總膽紅素是人體內(nèi)結(jié)合（直接）膽紅素與非結(jié)合（間接）膽紅素的總和.總膽紅素增加，通常是由于膽道阻塞、肝炎、肝硬化、溶血性綜合征和某些遺傳性酶缺乏所致.近年來一些研究表明，血液中膽紅素低于正常值常與冠心病有關(guān).因此，對(duì)人體的血清、血漿或尿液中總膽紅素的測定，是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)最常規(guī)的項(xiàng)目之一.目前，血清總膽紅素的測定方法主要有重氮法、膽紅素氧化酶法和釩酸氧化法.但重氮法試劑不穩(wěn)定［1］，膽紅素氧化酶法特異性好，幾乎不受溶血，脂濁等的干擾，但因酶的來源、純度、穩(wěn)定性及價(jià)格等原因難于推廣.釩酸氧化法的釩酸鹽對(duì)儀器和環(huán)境存在潛在的污染，甚至影響豆類作物的生長［2］，經(jīng)過使用各種化學(xué)氧化劑氧化膽紅素的實(shí)驗(yàn)研究，作者成功研制了一種亞硝酸鈉氧化法測定總膽紅素試劑，該試劑線性范圍寬、抗干擾性強(qiáng)、反應(yīng)曲線規(guī)范、能迅速達(dá)到終點(diǎn)且測定的準(zhǔn)確度和精密度高，無環(huán)境污染問題.
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 總膽紅素試劑試劑R1：檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液，pH 2.9，加有聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、EDTA-Na2.試劑R2：含亞硝酸鈉、氫氧化鈉及碳酸鈉.
1.1.2 對(duì)照試劑市售化學(xué)氧化法試劑盒.
1.1.3 質(zhì)控品英國朗道RANDOX公司生產(chǎn)，正常值27.2μmol/L（批號(hào)561UN），異常值80.4μmol/L（批號(hào)384UE）.
1.1.4儀器HITICH7060全自動(dòng)生化分析儀.
1.2 測定方法
測定總膽紅素的生化分析儀參數(shù)：終點(diǎn)法，檢測波長為450 nm（主）/546 nm（次），反應(yīng)溫度37℃，標(biāo)本10μL，試劑R1為240μL，試劑R2為60μL，第一試劑反應(yīng)時(shí)間300 s，第二反應(yīng)時(shí)間300 s.
2 結(jié)果
2.1 試劑R1緩沖體系及濃度選擇
分別配制100 mmol/L的檸檬酸和酒石酸緩沖液，pH均為2.9，其他實(shí)驗(yàn)條件不變，測定濃度為27.2、80.4μmol/L的質(zhì)控血清，反應(yīng)曲線檸檬酸緩沖液加入試劑R2前很平，加入后很快反應(yīng)到終點(diǎn).酒石酸緩沖液反應(yīng)較慢，不適宜高值膽紅素測定，故選用檸檬酸緩沖液.然后將pH 2.9的檸檬酸緩沖液配成50、100、150、200 mmol/L系列濃度，其他條件不變，測定高、低濃度質(zhì)控血清.結(jié)果顯示在100 mmol/L時(shí)，靈敏度最適合，穩(wěn)定性最好，結(jié)果最接近靶值，故選用100 mml/L的濃度.
2.2 檸檬酸緩沖液pH值的選擇
將檸檬酸緩沖液配成pH 1.0、1.5、1.9、2.4、2.9、3.4、3.9，其他條件不變，測定同一份質(zhì)控血清.結(jié)果顯示pH低于1.9時(shí)，反應(yīng)出現(xiàn)渾濁，影響結(jié)果測定.pH升高時(shí)反應(yīng)速度變慢，不利于高膽紅素標(biāo)本在規(guī)定時(shí)間內(nèi)達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn).當(dāng)pH 2.9時(shí)測定結(jié)果最好，故pH值確定為2.9.
2.3 試劑R2亞硝酸鈉最佳用量選擇
配制亞硝酸鈉濃度分別為1、2、4、6 mmol/L，其他條件不變，測定質(zhì)控血清.結(jié)果顯示亞硝酸鈉濃度過低，會(huì)導(dǎo)致高濃度標(biāo)本膽紅素氧化不徹底，反應(yīng)速度緩慢；亞硝酸鈉濃度過高，則會(huì)出現(xiàn)低值標(biāo)本“吸光度-時(shí)間”反應(yīng)曲線翹尾現(xiàn)象，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性.選擇亞硝酸濃度為4 mmol/L時(shí)測定結(jié)果為最佳.
2.4 試劑R1中表面活性劑的選擇
分別用溴化十六烷基三甲基銨和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）作為總膽紅素試劑的表面活性劑，發(fā)現(xiàn)試劑中分別加入0.25、0.50、1.0、2.0、4.0 g/L溴化十六烷基三甲基銨所測得結(jié)果均與對(duì)照試劑所測結(jié)果存在顯著差別，而當(dāng)試劑中分別加入0.25、2.5、5.0、10.0、20.0 ml/L的聚乙二醇辛基苯基醚測定標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)：含有10.0 ml/L以下聚乙二醇辛基苯基醚的試劑測得的總膽紅素結(jié)果值最接近對(duì)照試劑所測結(jié)果.但高于10.0 ml/L聚乙二醇辛基苯基醚會(huì)導(dǎo)致脂濁標(biāo)本結(jié)果明顯偏高，而低濃度時(shí)能加速總膽紅素的氧化速度，使得高總膽紅素標(biāo)本測定結(jié)果不偏低，從而保證有較寬的線性檢測范圍.故選用0.25 ml/L的聚乙二醇辛基苯基醚以滿足各種標(biāo)本檢測.
